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如何有效的开展动物睡眠剥夺实验呢?

虽然早已知道,睡眠在人类及哺乳animal的生命活动中具有十分重要的生理意义,但迄今为止,睡眠发生的确切机制却尚未完全阐明。根据睡眠时的脑电图、肌电图及眼球运动表现,可将睡眠分为非快速眼球运动睡眠( nonrapid eye movements,NREM)和快速眼球运动睡眠( rapid eye movement,REM)或快波睡眠。睡眠剥夺( sleep deprivation)是研究睡眠的功能与发生机制的重要方法,睡眠剥夺模型的选择,将直接影响睡眠剥夺实验的可靠性及准确性,对睡眠剥夺实验结果具有重要的影响。现将几种常用的rat睡眠剥夺模型的方法、评价及进展情况综述如下。

1 平台睡眠剥夺技术( platform technique)

此类方法又称为花瓶技术( flower pot technique),主要是利用rat畏水及在水中无法进入睡眠的生活习性,通过在盛水的水槽中放置平台,让rat站立在平台上,因平台直径足够小(直径6.5cm或更小),当rat进入REM时,因全身肌张力降低引起节律性低头、触水,以此来达到剥夺REM的目的。此类方法简单易行,无需复杂昂贵的设备,在不同条件的实验室均能开展,因而应用广泛。其主要用来剥夺rat的REM,可分为以下三种方法:

1.1 单平台睡眠剥夺法( single platform method,SP)

此方法最早于1964年由 Jouvet等应用在猫的睡眠剥夺实验中,不久以后, Cohen将此方法应用于rat的睡眠剥夺实验。方法为将一圆柱形小平台(直径约65mm),放置在长400mmx宽340mmx高160mm的水槽中,往水槽中加水,至平台露出水面约10mm,将1只rat置于小平台上,rat可在平台上站立,可入NREM。当rat进入REM时,全身骨骼肌张力明显降低,颈部肌张力降低引起节律性低头、触水,从而无法进人REM。采用SP实验可引起animal的体重及胸腺重量减轻、肾上腺重量增加、血浆中肾上腺皮质酮(CORT)增加、animal攻击行为增加、机体免疫反应抑制等。因SP是单只rat进行实验,且在实验中rat的活动空间受限,故有学者认为以上的临床与实验室表现可能与rat的群体隔离或活动空间受限有关。进一步研究发现,在实验前群体饲养的animal,当与群体隔离后也会出现攻击行为增加、血浆中CORT增加、免疫功能抑制等表现,rat活动空间受限也可引起血浆中CORT的水平的增加。这些结果与单平台睡眠剥夺实验中见到的类似。为克服SP中rat与群体分离及活动空间受限的缺点,在SP基础上进一步发展为多平台睡眠剥夺法。

1.2多平台睡眠夺法( multiple platform method,MP)

MP法由 Van Hulzen等于1981年最先应用在rat睡眠剥夺实验中。在MP中,为扩展rat的活动空间,将小平台由SP中的1个增加至7个,仍将1只rat放在小平台间进行睡眠剥夺试验。因rat可以在7个小平台间自由活动,故活动范围较SP中有明显增大。经实验比较,在MP中,反映应激增强的一些指标,如肾上腺重量增加和胸腺重量减少仍然存在,甚至在rat血液中 ACTH,CORT的增加及肾上腺重量的增加较SP的更高,提示MP较SP有更强的应激性。考虑到rat为群居animal,单只rat实验易导致与所在群体的隔离。为克服群体隔离所带来的应激反应,有学者将MP法进一步改良,发展为改良多平台睡眠剥夺法。

1.3 改良多平台睡眠剥夺法( modified multiple platform method, MMPM)

在MMPM中,将10只rat(具体数目可根据实际需要确定)同时放在装有14或15个小平台的水槽中(长127cmx宽44cmx高45cm)进行实验,这样既避免了SP、MP中单只rat与群体隔离的缺点,又保留了MP中活动范围增大的特点。因在实验时rat多是3只或4只一笼进行饲养,如1组实验需10只rat,则需要3笼或4绝rat。考虑到来自不同笼中饲养2周,实验时再将这些rat放在一起同时进行睡眠剥夺实验,这样以克服实验时rat群体不稳定的缺点,从而将实验时的不确定因素减至最低。实验研究发现,在MMPM中,经采取措施保持rat群体稳定性及避免rat与群体分离后,rat肾上腺重量、体重减轻量、血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)和肾上腺皮质酮(CORT)的含量均较MP中为低,提示MMPM较MP具有更低的应激性,是较为理想的REM剥夺方法。

2 强迫运动睡眼剥夺法( forced locomotion technique)

此类睡眠剥夺方法形式多样,在脑电监护情况下可行全部的睡眠剥夺( total sleep deprivation,TSD)和选择性的睡眠剥夺( selective sleep deprivation,SSD)其共同特点是通过动力装置,迫使rat不停地运动,从而达到睡眠剥夺的目的。此类方法的优点是睡眠剥夺效果明显,睡眠剥夺的时间及强度易于掌、重复性好,无须实验人员随时观察实验情况,减轻了实验人员工作强度。缺点是长时间运动引起机体的一系列应激反应,可能干扰睡眠剥夺的实验结果。现选取其中两种有代表意义的方法介绍如下。

2.1水平转盘睡眠剥夺法( large round horizontal platform method)

此方法应用广泛,又称为disk-over- water method、由 Rechtschaffen等于1983年最先应用在睡眠剥夺实验中。实验装置由一个电脑控制台、一个水平转盘及两个开放的长方形有机玻璃缸组成。转盘直径为46cm,在电脑控制下可以按顺时针、逆时针方向随机水平转动。两只有机玻璃缸的尺寸均为长60cmx宽20.5cmx高60cm,在距离缸底5cm处的缸侧壁开有一条缝隙,使转盘的一半能分别从缝隙伸入两只玻璃缸中,并能随意转动。缸底留置水约2cm深,转盘离水面约3cm。实验前1周将睡眠剥夺rat头颈部植入微电极,并将微电极与电脑控制台相连。将rat放在转盘上适应环境1周,每天约1h,让rat习惯在转盘上活动、进水、进食等。实验时将实验组的rat及对照组的rat分別置于两只缸中的转盘上,当电脑通过微电极监测到实验组rat进入慢波或快波睡眠的脑电信号后,立即发出指令使转盘转动6s(6s内转动1/3圈),当rat被转到玻璃缸壁时,因被玻璃缸壁挡住而可能掉入水中。每次在实验组睡眠剥夺rat进人睡眠时转盘即转动6s,方向随机,转盘转动时两只rat均被动地随着转盘移动。此方法一次只剥夺一只rat睡眠,当实验组的睡眠剥夺rat在运动,进食时,转盘并不转动,而此时对照组的rat则可以趁机睡觉,以弥补被剥夺的睡眠。此方法中睡眠剥夺组rat与对照组rat条件极其相似,因而可减少因实验条件不同而所致的应激反应,可进行TSD和SSD实验。

2.2 旋转圆筒睡眠剥夺法( rotating drum method)

此方法于1979年由 Alexander等最先应用于睡眠剥夺实验中。设备主要由一柱形圆筒及一小型慢速马达构成。圆筒直径30cm,高30cm,圆筒底由PVC(聚氯乙烯)构成,侧壁由直径为10.4mm的PVC杆围成,杆长度30cm,杆之间间隔15.5mm,圆筒与小型马达相连,马达转速为每45s转1圈(也有学者应用每min转1圈)。至少在实验前2d,每天将rat放入圆筒中适应环境1次,适应时间不少于3h。实验时将马达按45s1圈进行匀速转动,通过圆筒的转动带动rat不停运动而达到睡眠剥夺的目的。此类方法简单易行,睡眠剥夺效果明显,缺点是长时间不停运动,可引起机体的运动后应激反应及身体疲劳,可能干扰睡眠剥夺实验结果。此类方法发展出多种变化Marcos等在进行新生rat睡眠剥夺时将简旋转速调节至2-3 r/min,后期逐渐增加至6-7 r/min, Shen等将圆筒在30s内旋转180°,每5min旋转一次以达到睡眠剥夺的目的。

 3 轻柔刺激法( method of gentle handling)

      此方法在短期的睡眠剥夺实验中应用较多。当实验人员通过观察rat行为或通过脑电波监护观察到rat进入睡眠时,通过轻轻拍打rat笼子,或应用声音、光线的刺激促使rat保持清醒,必要时还可用纸卷、铅笔或用手直接触摸rat,使rat无法进入睡眠。注意不能将rat移出笼外。此方法简单易行,在脑电监护情况下可进行TSD或SSD实验。在无脑电监护时,需要实验人员在旁不间断观察rat行为,易导致实验人员的睡眠剥夺,故较适合较短时间的睡眠剥夺实验。

 4 药物睡眠剥夺法

      定时给rat注射药物(多为一些中枢兴奋药),也可剥夺部分或全部睡眠,如注射咖啡因、去氧麻黄碱、特殊的神经毒素(DSP-4)、可乐定等。此类方法简单易行,操作方便,不需要特殊仪器。缺点是rat存在个体差异,睡眠剥夺的效果及程度及不易掌握。多用在研究某些特殊药物药理作用的实验中。